Клеточная культура является одним из наиболее важных инструментов, используемых в клеточной и молекулярной биологии, обеспечивая превосходную модельную систему для изучения нормальной физиологии и биохимии (например, метаболические исследования, старение), воздействия лекарств и токсичных соединений на клетки, а также воздействия клеточного мутагенеза и канцерогенеза. Он также используется при проверке и разработке лекарств и в крупномасштабном производстве биологических соединений (например, вакцин, терапевтических белков). Основным преимуществом использования клеточной культуры для любого из этих приложений является согласованность и воспроизводимость результатов, которые могут быть получены при использовании партии клональных клеток.
культура клеток
Клеточная культура относится к изъятию клеток у животных или растений и их выращиванию в благоприятной искусственной среде. Клетки могут быть удалены непосредственно из ткани и диссоциированы ферментативно или механически перед культивированием, или они могут быть получены из установленных клеточных линий или штаммов.
1. Начальная подготовка
Первичная культура относится к стадии культивирования после того, как клетки были выделены из ткани и размножены в соответствующих условиях до тех пор, пока они не займут весь доступный субстрат (т.е. не достигнут слияния). На этой стадии клетки должны быть пересеяны (т.е. пассированы) путем переноса их в новый контейнер со свежей питательной средой, чтобы обеспечить больше места для продолжения роста.
2. Клеточные линии
После первого пересева первичные культуры называются клеточными линиями или субклонами. Клеточные линии, полученные из первичных культур, имеют конечную продолжительность жизни (т. е. они конечны), и при их пассировании преобладают клетки с самым высоким потенциалом роста, что приводит к степени генотипического и фенотипического единообразия популяции по полу.
3. Клеточные линии
Клеточная линия становится клеточным штаммом, если субпопуляция клеточной линии активно отбирается из культуры путем клонирования или других методов. Клеточные линии часто приобретают дополнительные генетические изменения после инициации родительской линии.
4. Ограниченные клеточные линии и непрерывные клеточные линии
Нормальные клетки обычно делятся только ограниченное количество раз, прежде чем теряют способность к пролиферации, что является генетически детерминированным событием, называемым старением; эти клеточные линии называются конечными. Однако некоторые клеточные линии становятся бессмертными в результате процесса, называемого трансформацией, который может происходить спонтанно или индуцироваться химическим или вирусным путем. Конечная клеточная линия становится непрерывной клеточной линией, когда она претерпевает трансформацию и приобретает способность неограниченно делиться.
Непрерывно культивируемые клеточные линии склонны к генетическому дрейфу, конечные клеточные линии обречены на старение, все клеточные культуры восприимчивы к микробному загрязнению, а отказ оборудования может произойти даже в самых лучших лабораториях. Поскольку установленные клеточные линии являются ценным ресурсом, замена которого требует больших затрат и времени, важно криоконсервировать их для длительного хранения.
Как только небольшое количество оставшихся клеток будет получено в результате пересева, их следует заморозить в качестве посевного материала и защитить от общего лабораторного использования. Рабочие запасы можно приготовить и пополнить из замороженных запасов семян. Если семенной фонд истощен, то криоконсервированный рабочий материал можно использовать в качестве источника для приготовления свежего семенного фонда с минимальным увеличением количества по сравнению с первоначальным замораживанием.
Лучший способ криоконсервации культивируемых клеток — в жидком азоте, в полной среде, в присутствии криопротекторов, таких как диметилсульфоксид (ДМСО) или глицерин. Криопротекторы снижают температуру замерзания среды, а также снижают скорость охлаждения, значительно снижая риск образования кристаллов льда, которые могут повредить клетки и привести к их гибели.
Известно, что ДМСО способствует проникновению органических молекул в ткани. При работе с реагентами, содержащими диметилсульфоксид, следует использовать оборудование и методы, соответствующие опасности этого материала. Утилизируйте реагенты в соответствии с местными правилами.
Выращивание клеток из замороженных рабочих клеточных запасов
Обязательно заполните журнал мобильного банкинга
Определите количество пассажей, например, если предыдущие клетки были заморожены и оттаивались три раза, процесс оттаивания будет четвертым пассажем.
Добавьте питательную среду (минимальную среду, сыворотку теленка и антибиотики) в колбы T75, помеченные клеточной линией, номером пассажа и датой.
Поместите колбу горизонтально в инкубатор CO при 37 градусах и 5 процентах CO в течение не менее 15 минут. Это нагреет среду и доведет ее до нормального pH (7.0-7.6).
Разморозьте замороженные флаконы с клеточными линиями на водяной бане при температуре 37 градусов при осторожном встряхивании. Чтобы снизить риск загрязнения, держите уплотнительное кольцо и крышку над уровнем воды (2-5 минут).
Поместите флакон в бокс биологической безопасности (BSL-2). Во избежание загрязнения протрите флакон 70-процентным этанолом, прежде чем открывать флакон.
Перенесите содержимое колбы с замороженными клетками в колбу T75, содержащую ростовую среду. Аккуратно перемешайте и встряхните колбу, чтобы клетки равномерно распределились по поверхности колбы.
Инкубируйте колбу в течение ночи в инкубаторе с СО2 при 37 градусах с 5-процентным содержанием СО2. Разрешить клеткам прикрепляться на ночь
изменение среды роста
Инкубируйте колбу в течение дополнительных 2-4 дней при температуре 37 градусов , 5 процентах CO2 и следите за ростом клеток.
Как только клетки достигают приблизительно 90-процентной конфлюэнтности, клеточный фонд может быть расширен с использованием колбы T150.
