1. Восстановление
●1. Выньте криопробирку из жидкого азота, сразу же поместите ее в водяную баню с температурой 37 градусов и слегка встряхните. После того, как жидкость растает (около 1-1,5 минут), выньте ее, обрызгайте спиртом и положите на сверхчистый верстак.
●2. Аспирируйте вышеуказанную клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл, наполненную 10 мл среды (промойте пробирку для криоконсервации средой, чтобы смыть все клетки, прилипшие к стенке), и центрифугируйте при 1000 об/мин в течение 5 минут.
●3. Слейте супернатант и добавьте 1 мл среды, чтобы суспендировать клетки. Аспирировали в чашку Петри диаметром 10 см, содержащую 10 мл культуральной среды, и осторожно встряхивали туда-сюда для равномерного распределения клеток в чашке Петри.
●4. Пометьте тип и дату клеток, название культиватора и т. д. и поместите их в инкубатор CO2 для культивирования. После того, как клетки прилипнут к стене, измените среду.
●5. Меняйте среду каждые 3 дня.
2. Прохождение
●1. Пассаж, когда покрытие клеток в чашке для культивирования достигает 80 процентов -90 процентов.
●2. Аспирируйте исходную среду.
●3. Добавьте соответствующий трипсин (достаточно, чтобы покрыть клетки) и переваривайте в течение 1-2 минут.
●4. После округления клеток добавьте равный объем среды, содержащей сыворотку, чтобы прекратить пищеварение.
●5. Используйте пипетку, чтобы приостановить клетки с помощью пипетки.
●6. Аспирируйте клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 1000 об/мин в течение 5 минут.
●7. Слейте супернатант, добавьте 1-2мл среды и взорвите клетки.
●8. Перенесите клетки на несколько блюд в зависимости от типа клеток. Как правило, есть 5 раковых клеток и 3 нормальных клетки. Продолжайте культивировать.
3. Криоконсервация Переварить клетки и центрифугировать (там же). Подвесьте клетки приготовленным раствором для замораживания и разложите по стерилизованным криопробиркам, дайте постоять несколько минут и укажите тип клеток и дату криоконсервации. 4 градуса в течение 30 минут, -20 градусов в течение 30 минут, -80 градусов в течение ночи, а затем помещают в жидкий азот для хранения. Приготовление раствора для криоконсервации: 70% полная среда плюс 20% FBS плюс 10% ДМСО. ДМСО следует добавлять медленно по каплям, встряхивая при капании.
