Сегодня поговорим о ключевом элементе ПЦР-экспериментов — расходных материалах. Как частый посетитель PCR, необходимо понимать характеристики и терминологию, связанную с расходными материалами PCR.
На рынке представлен широкий выбор расходных материалов для ПЦР, включая бренды, спецификации, цвета и т. д., которые поражают воображение. Давайте разбираться шаг за шагом.
пластина для пцр
1. Материалы
Обычно сырьем для расходных материалов ПЦР является полипропилен. Это хороший термостойкий инертный материал. Диапазон рабочих температур составляет от -30 до 140 градусов, что позволяет ему выдерживать изменения тепловой энергии во время термического цикла реакции ПЦР и играет хорошую роль в герметизации и защите веществ в реакционной системе ПЦР.
Узнать больше о полипропилене
2. Цвет
Обычными являются белые пробирки и прозрачные пробирки для ПЦР. В традиционных экспериментах с ПЦР между ними нет никакой разницы. Однако в том же эксперименте в режиме реального времени/количественной ПЦР белые пробирки были относительно более чувствительными и стабильными для приборов количественной ПЦР с считыванием апикального сигнала (см. рисунки А и В ниже). почему это так?
пробирка для пцр
A: более низкие значения Ct для белых пробирок по сравнению с прозрачными пробирками; B: лучшая воспроизводимость с белыми трубками.
Основными данными qPCR является значение Ct, а сигнал флуоресценции является источником данных для расчета значения Ct, поэтому очень важно, может ли флуоресценция в пробирке полностью передаваться на детектор. Белая стенка пробирки препятствует прохождению флуоресценции через стенку пробирки и ее преломлению (рис. А ниже), тем самым предотвращая передачу флуоресценции на нагревательный блок (т. е. стенку металлического отверстия, куда помещается пробирка) и ее поглощение. или непоследовательно отражается блоком. На кончике белой трубки был собран более сильный и концентрированный флуоресцентный сигнал по сравнению с прозрачной трубкой (рис. B ниже).
пробирка для пцр
A: тенденция изменения сигнала флуоресценции в прозрачной трубке и белой трубке; B: Сравнение интенсивности флуоресценции после добавления того же количества флуоресцеина.
Поэтому, если вы используете прибор для количественной ПЦР с лучшими показаниями, попробуйте белые пробирки.
3. Качество (бережливое или небережливое)
Здесь подчеркивается важность качества расходных материалов. Расходные материалы для количественной ПЦР не должны содержать загрязнений и ингибиторов. Высокое давление и радиация удаляют бактерии и ДНКазы, но не пыль и остатки ДНК, которые могут ингибировать реакции ПЦР или вызывать неспецифическую амплификацию. Вещества обладают поглощающей способностью, и даже крошечные загрязняющие вещества будут поглощать флуоресценцию в реакционной системе и влиять на сбор сигналов флуоресценции. Преувеличенная версия эксперимента использовалась для демонстрации влияния загрязнения примесями на эксперимент. Как показано на рисунке ниже, в одну из реакционных ям октавы была помещена примесь. Как и ожидалось, кривые усиления показали заметные аномалии.
Примеси в реакционных пробирках для ПЦР
↑ Примеси в реакционной трубке
8 полосок
↑ Повторные результаты реакции для 8 пробирок, примесь в левой лунке «отклоняется» от кривой.
Напоминание: Будьте осторожны, не подвергайте расходные материалы воздействию воздуха в течение длительного времени. После извлечения расходных материалов обязательно быстро закройте упаковочный пакет, чтобы не касаться его голыми руками. Если возможно, работайте на чистом столе.
4. Емкость/размер/поток
Объем определяет, сколько образца (реакционного объема) можно загрузить. Передозировка может привести к снижению эффективности теплопередачи, утечке или перекрестному загрязнению; недостаточная дозировка может привести к потере образца при испарении. Блок нагрева прибора для количественной ПЦР также определяет применимые расходные материалы и подходящий размер реакционной системы. Пропускную способность легко понять, это максимальное количество образцов, которые можно загрузить за один эксперимент. Общие характеристики производительности и потока показаны в таблице ниже:
Одна пробирка/восемь рядов {{0}}.2 мл, 0,1 мл
{{0}}луночный планшет 0,2 мл, 0,1 мл
{{0}}луночный планшет 0,2 мл
Характеристики емкости также обычно делятся на стандартные и низкие типы, как показано ниже. Низкопрофильные расходные материалы имеют меньшую высоту. Эта короткая конструкция сводит к минимуму пространство над реакционной системой («мертвый объем» — бесполезная часть), уменьшает эффекты испарения во время термоциклирования и позволяет нагревательному модулю в большей степени охватывать ее для повышения эффективности теплопередачи. Поэтому низкопрофильные трубы также известны как «быстрые» трубы или пластины.
пробирка для пцр
Напоминание: Обычно используемый реакционный объем составляет 20 мкл, и рекомендуется использовать реакционную пробирку малого объема 0,1 мл или небольшого объема.
5. Толщина стенки
Толщина стенки трубы напрямую влияет на теплопроводность. Расходные материалы для ПЦР должны иметь одинаковую толщину стенок для обеспечения постоянной теплопередачи. Ультратонкая стенка трубки на 50 процентов тоньше, чем в стандартной версии, что еще больше снижает тепловой барьер и обеспечивает более быстрый и лучший эффект отклика. Таким образом, чтобы максимизировать эффективность реакций ПЦР и обеспечить стабильность и эффективность реакций, оптимальным выбором являются однородные и ультратонкие расходные материалы для ПЦР.
6. Прозрачность
Крышки и защитные пленки для количественной ПЦР требуют высокой оптической прозрачности для обеспечения оптимального проникновения и передачи флуоресцентных сигналов при одновременном снижении искажений (для приборов количественной ПЦР с максимальным считыванием). Чем выше прозрачность стенки трубки, это может повлиять на результаты эксперимента. Причина описана выше. Традиционная ПЦР может игнорировать эту функцию.
7. Юбки
Юбка планшета для ПЦР относится к периферийному расширению планшета. При создании реакционных систем юбка выступает в качестве стабильной опоры для процессов пипетирования и обеспечивает механическую прочность и сцепление в сочетании с автоматизированными рабочими станциями. Существует три распространенных типа юбок: полуюбки и полные юбки (соответствующие A, B и C на рисунке ниже).
Без юбки: может использоваться с большинством инструментов для ПЦР или количественной ПЦР, но не для автоматизированных приложений. Легко перемещается во время пипетирования, не очень стабилен, необходимо использовать с держателем планшета.
Полуюбки: идеально подходят для автоматизированных приложений с хорошей стабильностью пипетирования.
Полная юбочная пластина: идеально подходит для автоматизированных приложений. Хорошая механическая прочность, подходит для инструментов ПЦР с выступающими модулями, высокая стабильность при пипетировании.
пластина для пцр
Советы: значение юбки больше для облегчения индустриализации и автоматизированной пакетной обработки в сочетании с роботизированной рукой. В традиционных исследовательских лабораториях она может не понадобиться, юбки недостаточно.
пластина для пцр
8. Парафильм
Запечатывающая пленка для планшетов для ПЦР изготовлена из прозрачного пластика или алюминиевой фольги. Клейкие прозрачные пленки более распространены, подходят для 96- или 384-луночных планшетов и должны иметь достаточно хорошее светопропускание. При запечатывании пленки небольшая карта будет использоваться для прижатия пленки к отверстию для запечатывания, чтобы избежать утечки воздуха.
Клейкие алюминиевые пленки могут быть менее распространены. Хотя он и не подходит для количественной ПЦР, он является идеальным расходным материалом для светочувствительных образцов. Поскольку его можно перфорировать, он облегчает перенос образца в ПЦР (для обычной ПЦР).
Запечатывающая пленка для планшетов для ПЦР
Подведем итог
Как носитель системы ПЦР, расходные материалы очень важны для улучшения качества экспериментальных данных. Я надеюсь, что этот обмен поможет вам понять некоторые советы по расходным материалам для ПЦР и помочь в их выборе.