Что такое клеточная культура?
культура клеток
Клеточная культура относится к процессу выращивания клеток в контролируемых условиях вне их естественной среды. Это инструмент in vitro, который облегчает понимание клеточной биологии и механизмов заболевания. Он также играет роль в открытии лекарств, таких как тестирование токсичности лекарств и фармакокинетические/фармакодинамические исследования, а также в персонализированной медицине.
Американский эмбриолог Росс Грэнвилл Харрисон разработал первые методы культивирования клеток in vitro в начале 20 века, когда он успешно вырастил фрагменты ткани из эмбрионов лягушки in vitro. Сегодня культура клеток помогла бесчисленным открытиям, таким как разработка вакцин против полиомиелита, кори, эпидемического паротита и других инфекционных заболеваний.
Адгезия и суспензионная культура
Существуют две основные системы роста клеток: адгезивная культура и суспензионная культура. Адгезивные культуры выращивают на искусственных субстратах, а клетки в суспензионных культурах свободно плавают в среде. В то время как только несколько типов клеток растут естественным образом в суспензии (например, лимфоциты), многие типы адгезивных клеток могут быть адаптированы к суспензионной культуре.
Есть две причины для культивирования естественно прикрепленных клеток в суспензии. Первое преимущество суспензионной культуры заключается в том, что клетки легче пассировать, потому что вам не нужно ферментативно или механически отделять их от сосуда для культивирования. Во-вторых, суспензионные культуры легче масштабировать, поскольку рост клеток ограничивается только их концентрацией в среде, а не доступной площадью поверхности. Основным недостатком суспензионных культур является то, что они требуют ежедневного подсчета клеток и анализов жизнеспособности для отслеживания моделей роста, тогда как прилипшие культуры можно легко исследовать под микроскопом.
2D и 3D методы
Адгезивные культуры можно разделить на 2D- и 3D-культуры. В 2D-приложениях прикрепленные клетки выращивают в монослойной системе на плоской поверхности, например, в колбе для культивирования клеток.
культура клеток
Из-за своей простоты 2D-технология не может имитировать среду клеток in vivo, которые обычно растут в трехмерных структурах со сложными межклеточными взаимодействиями. Вот почему некоторые эксперименты проводятся с использованием 3D-культур, которые можно выращивать с использованием технологий на основе каркасов или без них.
3D-методы на основе каркасов обычно включают выращивание прикрепленных клеток в каркасах из гидрогеля. Альтернативы, такие как биокерамические, металлические или полимерные каркасы, также используются для некоторых приложений.
Методы без каркасов используются для выращивания сфероидов одним из трех различных методов:
Принудительное плавание: загрузите клеточную суспензию в лунки микропланшета с полимерным покрытием с низкой адгезией. Затем микропланшет центрифугируют, чтобы заставить клетки сформировать сфероиды.
Висячая капля: клеточную суспензию загружают в лунки планшета с висячей каплей. Как следует из названия, суспензия будет висеть на пластине в виде капель. Клетки будут собираться на кончиках этих капель и образовывать сферы.
На основе перемешивания: клеточную суспензию помещают во вращающийся биореактор. Из-за постоянного перемешивания клетки не могли прикрепляться к стенкам, образуя сфероиды.
Вызов клеточной культуры
Несмотря на различия в методах и техниках, все эксперименты объединяет одно: трудно вырастить живые клетки в необходимом количестве для получения воспроизводимых результатов. Поэтому следующие разделы будут посвящены четырем проблемам — повторяемости, загрязнению, осуществимости и переходу к автоматизации.
воспроизводимость
Согласно опросу, проведенному Yongyue Medical, более 70 процентов ученых сообщили, что им не удалось воспроизвести эксперименты другого ученого, и более половины не смогли воспроизвести свою собственную работу. В анализах клеточных культур большинство проблем с воспроизводимостью возникает из-за биологических различий между клеточными пассажами или поколениями. Еще одной большой проблемой является неправильная идентификация клеточных линий, и несоответствия в параметрах культуры также играют важную роль.
биологическая изменчивость
Такие факторы, как случайные мутации или ошибки транскрипции, могут влиять на воспроизводимость экспериментов каждый раз, когда клетка делится. Чтобы избежать этого, вам следует создать банк ячеек в начале нового проекта.
сотовый банк
Банк клеток относится к процессу хранения партий определенных типов клеток для последующего использования, чтобы избежать таких факторов, как случайные мутации или ошибки транскрипции, которые влияют на воспроизводимость. Первым шагом является создание основного банка клеток (MBC) путем выращивания выбранных типов клеток, представляющих интерес, в культуре и их криоконсервации в нескольких контейнерах. Партии МБК размораживают и позже используют для приготовления рабочих банков клеток (РБК).
Неверная идентификация клеточных линий
Проблема неправильной идентификации клеточных линий известна с 1960-х годов, когда ученый описал заражение клетками HeLa 19 других клеточных линий человека. Чтобы убедиться, что ваши результаты надежны и, что более важно, чтобы вы не сделали ложных выводов, вы должны изолировать все новые клеточные линии, поступающие в лабораторию, до тех пор, пока не будет подтверждено их происхождение. Самое главное, рекомендуется повторить квалификацию клеточной линии перед криоконсервацией и распределением в другие лаборатории, а также после завершения проекта. Чтобы проверить клеточную линию, вы должны сначала проверить, есть ли она в реестре ошибочно идентифицированных клеточных линий. Если он не зарегистрирован, вам все равно нужно подтвердить его подлинность. Для клеточных линий человека рекомендуется анализ коротких тандемных повторов (STR) (дактилоскопия ДНК). Для нечеловеческих клеточных линий доступны различные методы тестирования, включая кариотипирование, изоферментный анализ и типирование митохондриальной ДНК (штрих-кодирование ДНК).
Параметры культуры
Третьим фактором, влияющим на воспроизводимость, являются параметры культуры.
Например, уровень кислорода может существенно влиять на культивируемые клетки. Однако переменные, влияющие на оксигенацию, такие как размер камеры или плотность клеток, не всегда документируются и, следовательно, не могут быть согласованными.
Еще одним важным параметром культуры является среда. Это обеспечивает необходимые питательные вещества, факторы роста и гормоны, а также регулирует рН и осмотическое давление. Поэтому самое главное, чтобы его состав всегда был одинаковым. Это особенно важно для составов сред с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), состав которых зависит от таких факторов, как рацион коровы, географическое положение и время года. Чтобы свести к минимуму влияние FBS на воспроизводимость результатов, вы должны заказать разные партии сыворотки, когда текущие запасы начинают заканчиваться, и протестировать их, чтобы найти наиболее близкое соответствие. Чтобы другие могли воспроизвести ваши результаты, вы должны сообщить, как вы проводили скрининг сыворотки, и записать номер партии.
культура клеток
Обработка ячеек
Большинство исследователей знают, что параметры культуры оказывают огромное влияние на их приложения, но часто упускают из виду изменения в методах обработки.
Загрязнение
Когда клетки выделяют из ткани и выращивают в лаборатории, они больше не защищены иммунной системой и поэтому чрезвычайно уязвимы для заражения.
Первым источником загрязнения являются абиотические загрязнители, такие как примеси в культуральной среде, сыворотке, добавках или воде, а также эндотоксины и вымываемые вещества. Меры предосторожности включают использование воды лабораторного качества для экспериментов с клеточными культурами, а также сред, сыворотки, добавок и расходных материалов от производителей, которые предлагают сертификацию тестирования эндотоксинов. Кроме того, расходные материалы должны быть изготовлены из первичного полистирола или полипропилена, чтобы пластиковые добавки не просачивались в культуру клеток.
Вторым источником загрязнения являются биологические загрязнители, такие как бактерии (включая микоплазму), грибы и дрожжи.
осуществимость
Жизнеспособность клеток определяется как доля жизнеспособных клеток в образце. В дополнение к загрязняющим веществам, которые мы только что видели, существует множество других факторов, влияющих на жизнеспособность клеток. Условия окружающей среды — температура, pH, осмотическое давление, доступность питательных веществ и концентрации O2 и CO2 — очень важны. Большинство этих переменных контролируются средой и зависят от типа клеток, что, к сожалению, означает, что мы не можем предоставить конкретные рекомендации.
Поскольку клетки очень чувствительны к давлению, вам следует обращать внимание не только на условия окружающей среды, но и на ваши методы обращения с жидкостями.
Последним фактором, влияющим на жизнеспособность клеток, является старение. Большинство конечных клеточных линий переживают от 20 до 60 делений перед смертью, что означает, что они могут быть повторно использованы только между 15 и 45 поколениями. После этого криоконсервированный образец необходимо разморозить из банка клеток. Непрерывные клеточные линии могут размножаться бесконечно, но поскольку они склонны к генетическому дрейфу, их следует регулярно заменять.
Анализы обнаружения с использованием колориметрических, флуорометрических и биолюминесцентных методов могут использоваться для измерения жизнеспособности клеток. Наиболее часто используемым колориметрическим методом является метод МТТ, основанный на восстановлении желтых солей тетразолия живыми клетками до пурпурных кристаллов формазана.
96-луночные планшеты
автоматизация
Многие из описанных выше проблем можно решить, автоматизировав рабочие процессы культивирования клеток. Например, обработка клеток всегда будет последовательной, что положительно скажется на воспроизводимости и жизнеспособности. Самое главное, автоматизация снижает риск заражения пользователя.
Несмотря на эти преимущества, автоматизация рабочих процессов в целом может быть сложной задачей из-за нехватки средств, нехватки места для роботов или из-за нехватки ресурсов для автоматизации и одновременной проверки каждого шага. Но это решаемо!
