1. Восстановление клеток
После извлечения криоконсервированных клеток из жидкого азота их оттаивали при постоянном встряхивании на водяной бане при температуре 37 градусов. Перенесите размороженные клетки в центрифужную пробирку, добавьте предварительно подогретую полную среду DMEM при 37° (из которой сыворотка эмбриона крупного рогатого скота составляет около 10 процентов), аккуратно равномерно продувайте, центрифугируйте при 500 g в течение 2 мин и отбрасывайте супернатант.
Добавьте полную среду DMEM для промывки и выбросьте супернатант. Добавьте полную среду DMEM, осторожно перемешайте с помощью пипетки, сделайте клеточную суспензию, засейте ее в чашку Петри/колбу и культивируйте в клеточном инкубаторе, содержащем 5% CO2.
2. Клеточный пассаж
Когда плотность клеток достигает 80 ~ 90 процентов (преждевременный выход недостаточен, слишком поздние клетки находятся в плохом состоянии, пересев в соотношении от 1: 2 до 1: 10 или более, как правило, от 1: 3 до 1: 5 генерации клеток, то есть из инокуляции клеток. Во время разделения и повторного культивирования полную среду удаляли и дважды промывали 1X PBS.
Добавьте трипсин (примечание: количество раствора для переваривания лучше всего покрывать клетки, а оптимальная температура переваривания составляет 37 градусов. Наблюдайте за клетками под микроскопом: наблюдайте за переваренными клетками под инвертированным микроскопом, если цитоплазма оттянута, клетки больше не связаны друг с другом. Срезы, указывающие на то, что клетки правильно перевариваются в это время), переварите их и поместите в инкубатор клеток примерно на 2-3 минут.
Добавьте соответствующее количество полной среды DMEM, чтобы остановить трипсинизацию, перенесите в пробирку для центрифуги и центрифугируйте при 500 г в течение 2 мин, выбросьте супернатант, добавьте полную среду DMEM для мытья и выбросьте супернатант.
Добавьте полную среду DMEM, аккуратно перемешайте пипеткой, отберите 10 мкл для подсчета и затем продолжите культивирование в клеточном инкубаторе, содержащем 5% CO2, в соответствии с требуемым объемом клеток.
3. Криоконсервация клеток
Когда плотность клеток достигает 80% ~ 90%, удалите полную среду и промойте 2 раза 1X PBS. Добавьте трипсин для пищеварения и поместите в клеточный инкубатор примерно на 2-3 мин. Добавьте полную среду DMEM, чтобы остановить расщепление трипсина, перенесите в центрифужную пробирку и центрифугируйте при 500 г в течение 2 мин, выбросьте супернатант, добавьте полную среду DMEM для мытья и выбросьте супернатант. Добавьте 1 мл раствора для замораживания (90 % фетальной телячьей сыворотки, 10 % ДМСО). Вообще говоря, содержание сыворотки можно регулировать в пределах от 10 до 90 %. Обеспечьте непроницаемыми защитными веществами во время криоконсервации клеток, такими как сахароза, альбумин и т. д., чтобы лучше защитить клетки), поместите его в пробирку для криоконсервации (в пробирке есть изопропиловый спирт для обеспечения скорости снижения температуры), немедленно поместите его Заморозьте в холодильнике при 4 градусах на 30 минут, затем поместите в холодильник при температуре -20 градусов на 30 минут, а затем поместите в холодильник при температуре -80 градусов на ночь.
Поместите его в жидкий азот на следующий день, он может храниться не менее двух лет, а если не поместить его в жидкий азот, он может храниться в течение трех месяцев.
Принцип криоконсервации и восстановления клеток: медленное замораживание и оттаивание, что в большей степени способствует сохранению жизнеспособности клеток. Криоконсервация клеток без какого-либо защитного агента приведет к образованию внутриклеточных кристаллов льда, которые вызовут эндогенное механическое повреждение клеток, вызовут изменения осмотического давления внутриклеточной среды, рН, электролитов и т. д., а затем будут способствовать гибели клеток.
4. Вопросы, требующие внимания
(1) Предварительный нагрев культурального раствора: поместите подготовленную бутыль, содержащую культуральный раствор, PBS и трипсин, в водяную баню до 37 градусов для предварительного нагрева;
(2) Используйте 75-процентный спирт для протирки сверхчистого верстака и рук, подвергшихся облучению ультрафиолетовыми лучами;
(3) Правильное размещение используемых инструментов: обеспечьте достаточное рабочее пространство, которое не только просто в эксплуатации, но и снижает загрязнение окружающей среды;
(4) Зажгите спиртовку: обратите внимание, что пламя не должно быть слишком маленьким;
(5) Строгие асептические операции;
(6) Умеренное переваривание прилипших клеток: время переваривания зависит от многих факторов, таких как тип раствора для переваривания, время приготовления и количество, добавленное в колбу для культивирования. В процессе пищеварения следует обращать внимание на изменение формы культивируемых клеток. Как только цитоплазма сморщивается, если соединение становится рыхлым или появляются признаки плавания кусочков, пищеварение следует немедленно прекратить;
(7) Все операции с пассированными клетками следует проводить как можно ближе к пламени спиртовки. Лучше всего работать только с одной ячейкой за раз, используя один комплект оборудования для каждой ячейки. избежать перекрестного заражения;
(8) Горловину флакона с пассированной кюветой необходимо стерилизовать на спиртовке каждый раз, когда она открывается или закрывается.
